Imagej Stack Moving Average

Converte um Hypervolume de volta para uma pilha de fatias. Produz uma única imagem que contém as imagens de uma pilha exibida em um formato de grade. Isso pode ser útil para comparações visuais de uma série de imagens armazenadas em uma pilha. Uma caixa de diálogo permite que você especifique o nível de ampliação (fator de escala) no qual as imagens são copiadas e para selecionar o layout da grade resultante (Colums, Rows. First Slice. Last Slice. Increment). Com ImageJ 1.35m ou posterior, verifique Usar cor do plano de fundo para desenhar bordas e rótulos na cor do primeiro plano e preencher áreas em branco com a cor de fundo. Use a macro da ferramenta Montage Shuffler para reordenar as imagens na montagem. Reconstrua uma ou mais fatias ortogonais através do volume de imagem representado pela pilha atual. Antes de usar este comando, crie uma linha reta ou seleção retangular para especificar se as reconstruções serão feitas. Uma caixa de diálogo permite que você especifique o Z-Spacing (deslocamento entre fatias) do volume de origem. Múltiplas fatias são reconstruídas e salvas como uma pilha se você criar uma seleção retangular ou definir Largura da fatia maior do que uma. As imagens são criadas por amostragem de cada fatia na pilha ao longo da linha. Assim, o primeiro pixel em cada linha da imagem de saída é tirado do início da linha e o último do final. No caso em que Largura da fatia é maior do que uma, uma pilha é criada deslocando a linha para baixo e para a esquerda para gerar fatias adicionais para a pilha de saída. Este plugin e o plugin do ZProject. Foram contribuídos por Patrick Kelly e Harvey Karten, da Universidade da Califórnia, em San Diego. Projeta uma pilha de imagens ao longo do eixo perpendicular ao plano da imagem (o chamado eixo z). São suportados seis diferentes tipos de projeção. O comando ZProject cria nomes de imagens no formato XXXstack, onde XXX é AVG, MAX, MIN, SUM, STD e MED e pilha é o nome da pilha. A projeção de Intensidade Média exibe uma imagem em que cada pixel armazena a intensidade média em todas as imagens na pilha na localização correspondente do pixel. A projeção de intensidade máxima (Max) cria uma imagem de saída cada um dos quais contém o valor máximo sobre todas as imagens na pilha na localização de pixel em particular. A projeção de Intensidade Mínima (Min) cria uma imagem de saída com cada um dos pixels que contém o valor mínimo sobre todas as imagens na pilha na localização de pixel em particular. Sum Slices cria uma imagem real que é é a soma das fatias na pilha. O desvio padrão cria uma imagem real contendo o desvio padrão das fatias. A mediana cria uma imagem contendo o valor médio das fatias. Gera uma seqüência de animação projetando através de um conjunto de dados 3D rotativo em um plano. Cada quadro na sequência de animação é o resultado de projetar a partir de um ângulo de visão diferente. Para visualizar isso, imagine um campo de raios paralelos que passem por um volume contendo um ou mais objetos sólidos e atingindo uma tela orientada para as direções dos raios. Cada raio projeta um valor na tela, ou plano de projeção, com base nos valores dos pontos ao longo de seu caminho. Estão disponíveis três métodos para calcular as projeções para este plano: ponto mais próximo, ponto mais brilhante. E valor médio. A escolha do método de projeção e as configurações de vários parâmetros de visualização determinam como as estruturas de superfície e interior aparecerão. Esta rotina foi escrita por Michael Castle e Janice Keller, do Instituto de Pesquisa em Saúde Mental (MHRI) da Universidade de Michigan. Insira a imagem Dialog Selecione a projeção do ponto mais próximo para produzir uma imagem das superfícies visíveis a partir do ângulo de visão atual. Em cada ponto do plano de projeção, um raio passa normal para o plano através do volume. O valor do ponto não transparente mais próximo que o raio encontra é armazenado na imagem de projeção. A projeção de ponto mais brilhante examina pontos ao longo dos raios, projetando o ponto mais brilhante encontrado ao longo de cada raio. Isso exibirá os objetos mais brilhantes, como o osso em um estudo CT (tomografia computadorizada). Projeção de valor médio, uma modificação da projeção de ponto mais brilhante, soma os valores de todos os pontos transparentes ao longo de cada raio e projeta seu valor médio. Produz imagens com bordas mais macias e menor contraste, mas pode ser útil ao tentar visualizar objetos contidos dentro de uma estrutura de maior brilho (por exemplo, um crânio). Slice Spacing é o intervalo, em pixels, entre as fatias que compõem o volume. ImageJ projeta o volume no plano de visualização em cada Incremento de Ângulo de Rotação. Começando com o volume girado pelo ângulo inicial e terminando uma vez que o volume foi girado por rotação total. Os parâmetros de Transparência Limitada inferior e superior determinam a transparência das estruturas no volume. Os cálculos de projeção ignoram os pontos com valores inferiores ao limite inferior ou superior ao limite superior. A configuração desses limiares permite a criação de pontos de fundo (aqueles que não pertencem a nenhuma estrutura) invisíveis. Ao estabelecer limiares apropriados, você pode retirar as camadas com valores de intensidade razoavelmente uniformes e únicos e realçar (ou tornar invisíveis) as estruturas internas. Observe que você também pode usar ImageAdjustThresold para definir os limites de transparência. Às vezes, a localização das estruturas em relação a outras estruturas em um volume não é clara. O parâmetro Opacity permite a exibição de combinações ponderadas de projeção de ponto mais próximo com qualquer um dos outros dois métodos, muitas vezes dando ao observador a capacidade de visualizar estruturas internas através de superfícies externas translúcidas. Para habilitar esse recurso, defina Opacity como um valor maior que zero e selecione o valor médio ou a projeção do ponto mais brilhante. As pistas de profundidade podem contribuir para a qualidade tridimensional das imagens de projeção, dando perspectiva às estruturas projetadas. Os parâmetros de profundidade-cueing determinam se os pontos projetados que se originam perto do visualizador aparecem mais brilhantes, enquanto os pontos mais distantes são diminuídos linearmente com a distância. O trade-off para este realismo aumentado é que os pontos de dados mostrados em uma imagem detalhada não possuem valores densitométricos precisos. Estão disponíveis dois tipos de profundidade: a profundidade da superfície e a profundidade do interior - Cueing. Surface Depth-Cueing funciona apenas nas projeções do ponto mais próximo e o componente do ponto mais próximo de outras projeções com a opacidade ativada. Interior Depth-Cueing funciona apenas em projeções de pontos mais brilhantes. Para ambos os tipos, o ajuste de profundidade é desativado quando ajustado para zero (ou seja, 100 de intensidade na parte de trás para 100 de intensidade na frente) e está ativado quando ajustado a 0ltn 100 (ou seja, (100-n) de intensidade de volta a 100 de intensidade em frente). O aumento de profundidade independente para superfície (ponto mais próximo) e interior (ponto mais brilhante) permite mais possibilidades de visualização. Verifique Interpolar para gerar uma pilha temporária z-scale que é usada para gerar as projeções. Z-scaling elimina as lacunas observadas nas projeções de volumes com espaçamento de fatia maior que 1,0 pixels. Esta opção é equivalente a usar o plugin Scale do pacote TransformJ para dimensionar a pilha na dimensão z pelo espaçamento da fatia (em pixels). Esta caixa de seleção é ignorada se o espaçamento da fatia for menor ou igual a 1,0 pixels. A porcentagem de ROI significa o valor do cinza em relação ao número da fatia. Requer uma seleção. Anima a pilha ativa exibindo repetidamente suas fatias (quadros) em seqüência. Use Parar Animação. Ou clique com o mouse, para parar. Abra a caixa de diálogo Opções de animação para especificar a velocidade da animação. Mais de uma pilha pode ser animada de cada vez. Como um atalho, pressione a tecla da barra invertida () para iniciar ou parar a animação. No ImageJ 1.38 e posterior, pressione alt mais barra invertida para abrir a caixa de diálogo Opções de animação. Termina a animação da pilha ativa. Como um atalho, pressione a tecla barra invertida. Use esta caixa de diálogo para definir a velocidade da animação em quadros por segundo, configure o primeiro quadro e o último quadro (1.38 ou posterior), ou para ativar a animação oscilante (Loop Back e Forth). No ImageJ 1.38 ou posterior, você pode pressionar alt mais backslash (alt) para exibir esta caixa de diálogo. Guiimagestacks. txt middot Última modificação: 20100126 11:07 (edição externa) Limite Automático Este plugin binariza imagens de 8 e 16 bits usando vários métodos de thresholding globais (com base em histograma). A fase segmentada é sempre mostrada como branca (255). Para o limiar local, em vez de global, veja o plug-in Auto Local Threshold. ImageJ. Requer v1.42m ou mais recente. Copie o arquivo AutoThreshold. jar do mecourselandinigsoftwareautothreshold. jar na pasta ImageJPlugins e reinicie o ImageJ ou execute o comando Menus de atualização da Ajuda. Depois disso, um novo comando deve aparecer no Ajuste Automático da Imagem. Fiji. Este plugin faz parte da distribuição Fiji, não há necessidade de fazer o download. O método seleciona o algoritmo a ser aplicado (detalhado abaixo). As opções Ignorar preto e Ignorar branco definem as caixas de histograma de imagem para 0 e 255 níveis de habilidade para 0, respectivamente. Isso pode ser útil se a imagem digitalizada tiver pixels sub-expostos ou expostos. O objeto branco no fundo preto define para branco os pixels com valores acima do valor limite (caso contrário, ele define para branco os valores menores ou iguais ao limite). Set Threshold em vez de Threshold (imagens únicas) define o LUT limiar, sem alterar os dados de pixels. Isso funciona apenas para imagens individuais. Se você estiver processando uma pilha, duas opções adicionais estão disponíveis: a pilha pode ser usada para processar todas as fatias (o limiar de cada fatia será computado separadamente). Se esta opção for deixada desmarcada, somente a fatia atual será processada. O uso do histograma de pilha primeiro calcula o histograma da pilha inteira e, em seguida, calcula o limite com base nesse histograma e, finalmente, binariza todas as fatias com esse valor único. Selecionar esta opção também seleciona a opção Pilha acima automaticamente. 1. Este plugin é acessado através da entrada de menu Limite Automático da Imagem, no entanto, os métodos de limiar foram também parcialmente implementados no applet do Thresholder da ImageJs acessível através do Limite de Ajuste de Imagem. Entrada no menu. Enquanto o plug-in do Limite Automático pode usar ou ignorar os extremos do histograma da imagem (Ignorar preto, Ignorar branco), o applet não pode: o método padrão ignora os extremos do histograma, mas os outros métodos não. Isso significa que aplicar os dois comandos para a mesma imagem pode produzir resultados aparentemente diferentes. Em essência, o plugin Auto Threshold, com as configurações corretas, pode reproduzir os resultados do applet, mas não o caminho. 2. A partir da versão 1.12, o plugin suporta um limite de imagens de 16 bits. Uma vez que o plug-in do Limite Automático processa o espaço completo em escala de cinza, pode ser lento ao lidar com imagens de 16 bits. Observe que o applet do ImageJ thresholder também processa imagens de 16 bits, mas, na realidade, ImageJ primeiro calcula um histograma com 256 caixas. Portanto, pode haver diferenças nos resultados obtidos em imagens de 16 bits ao usar o applet e os verdadeiros resultados de 16 bits obtidos com este plugin. Note-se que, para acelerar, o histograma está encadernado para incluir apenas o intervalo de compartimentos que contêm dados (e evitar o processamento de caixas de histograma vazias em ambos os extremos). 3. O resultado de imagens e pilhas de 16 bits (ao processar todas as fatias) é um recipiente de 8 bits que mostra o resultado em branco 255 para cumprir o conceito de imagem binária (isto é, 8 bits com 0 e 255 valores). No entanto, para pilhas em que apenas 1 fatia é limiar, o resultado ainda é um contêiner de 16 bits com a fase limite definida como branco 65535. Isto é para manter os dados intocados nas restantes fatias. A opção tentar tudo conserva o formato de 16 bits para ainda mostrar as imagens com métodos que podem não conseguir obter um limite. As imagens e pilhas que são impossíveis de limiar permanecem inalteradas. 4. A mesma imagem em 8 e 16 bits (sem escala) retorna o mesmo valor de limiar, no entanto, o método Lis retornaria valores diferentes quando os dados da imagem foram deslocados (por exemplo, ao adicionar um valor fixo a todos os pixels). A implementação atual evita esse problema dependente do offset. 5. A mesma imagem escalada por um valor fixo (por exemplo, ao multiplicar todos os pixels por um valor fixo) retorna um resultado de limiar semelhante (dentro de 2 níveis de escala de escala da imagem original não escalada) para todos os métodos, exceto Huang, Li e Triângulo devido ao caminho Esses algoritmos funcionam. Qual método segmenta seus dados melhor Um pode tentar responder a esta pergunta usando a opção de experimentar tudo. Isso produz uma montagem com resultados de todos os métodos, permitindo explorar como os diferentes algoritmos funcionam em uma determinada imagem ou pilha. Ao usar pilhas, em alguns casos, pode não ser uma boa idéia segmentar cada fatia individualmente em vez de um único limite para todas as fatias (experimente o mri-stack. tif das imagens de amostra para entender melhor esta questão). Experimente todos os métodos. Ao processar pilhas com muitas fatias, as montagens podem se tornar muito grandes (16 vezes o tamanho original da pilha) e um corre o risco de ficar sem RAM. Uma janela pop-up aparecerá (quando as pilhas tiverem mais de 25 fatias) para confirmar se o procedimento deve exibir os resultados de montaged. Selecione Não para calcular os valores de limiar e exibi-los na janela de registro. Este é o método original de limiar automático disponível no ImageJ, que é uma variação do algoritmo IsoData (descrito abaixo). A opção Padrão deve retornar os mesmos valores que o Ajuste de Imagem Limiar Automático, ao selecionar Ignorar preto e Ignorar branco. Para indicar a segmentação da fase desejada, use a opção Objetos brancos no fundo preto. O método IsoData também é conhecido como intermediários iterativos. Implementos Huangs fuzzy thresholding método. Isso usa a função de entropia de Shannons (pode-se usar a função de entropia Yagers). Ported from ME Celebis fourier0.8 rotinas 1 e 2. Intermodes Isso assume um histograma bimodal. O histograma é suavizado iterativamente usando uma média de corrida de tamanho 3, até que existam apenas dois máximos locais: j e k. O limite t é então calculado como (jk) 2. As imagens com histogramas com picos extremamente desiguais ou amplas e no vale não são adequadas para esse método. Método do código MATLAB de Antti Niemists. Veja aqui uma excelente apresentação de slides e seu código MATLAB original. Procedimento iterativo com base no algoritmo isodata de: O procedimento divide a imagem em objeto e fundo, tomando um limiar inicial, então as médias dos pixels em ou abaixo do limite e pixels acima são calculadas. As médias desses dois valores são computadas, o limite é incrementado e o processo é repetido até o limite ser maior que a média composta. Ou seja, existem várias implementações deste método. Veja o código-fonte para outros comentários. Implementos Lis Minimum Cross Entropy método de thresholding baseado na versão iterativa (2ª referência abaixo) do algoritmo. Li, CH amp Lee, CK (1993), Minimum Cross Entropy Thresholding, Pattern Recognition 26 (4). 617-625 Li, CH amp Tam, PKS (1998), um algoritmo iterativo para limiar mínimo de entropia cruzada, cartas de reconhecimento de padrões 18 (8). 771-776 Sezgin, M amp Sankur, B (2004), Pesquisa sobre Técnicas de Limite de Imagem e Avaliação de Desempenho Quantitativo, Journal of Electronic Imaging 13 (1). 146-165. Ltciteseer. ist. psu. edusezgin04survey. html gt Ported from ME Celebis fourier0.8 rotinas 3 e 4. MaxEntropy Implements Kapur-Sahoo-Wong (Maximum Entropy) método de limiar: Kapur, JN Sahoo, PK amp Wong, ACK (1985), Um Novo Método para o Limite de Imagem de Nível de Grey Usando a Entropia do Histograma, Modelos Gráficos e Processamento de Imagem 29 (3). 273-285 Ported from ME Celebis fourier0.8 rotinas 5 e 6. Usa a média dos níveis de cinza como o limiar. É usado por alguns outros métodos como um primeiro limite de suposição. Glasbey, CA (1993), Uma análise de algoritmos de thresholding baseados em histograma, CVGIP: Modelos Gráficos e Processamento de Imagem 55. 532-537 MinError (I) Uma implementação iterativa do limiar mínimo de erros do Kittler e Illingworths. Esta implementação parece convergir com mais frequência do que o original. No entanto, às vezes o algoritmo não converge para uma solução. Nesse caso, um aviso é reportado à janela de log e o resultado é padrão para a estimativa inicial do limite que é calculado usando o método Mean. As opções Ignorar preto ou Ignorar branco podem ajudar a evitar esse problema. Kittler, J amp Illingworth, J (1986), limiar de erro mínimo, reconhecimento de padrões 19. 41-47 Ported de Antti Niemists Código MATLAB. Veja aqui uma excelente apresentação de slides e o código MATLAB original. Da mesma forma que o método Intermodes, isso assume um histograma bimodal. O histograma é suavizado iterativamente usando uma média de execução do tamanho 3, até que existam apenas dois máximos locais. O limiar t é tal que yt1 gt yt lt yt1. As imagens com histogramas com picos extremamente desiguais ou amplas e no vale não são adequadas para esse método. Com o código MATTAB de Antti Niemists. Veja aqui uma excelente apresentação de slides e o código MATLAB original. O método Tsais tenta preservar os momentos da imagem original no resultado limite. Ported from ME Celebis fourier0.8 rotinas 7 e 8. Algoritmo de agrupamento de limiar de Otsus procura o limiar que minimiza a variância intra-classe, definida como uma soma ponderada de variâncias das duas classes. Por parte do código C de Jordan Bevik. Percentile Assume que a fração de pixels de primeiro plano é 0,5. Com o código MATTAB de Antti Niemists. Veja aqui uma excelente apresentação de slides e o código MATLAB original. RenyiEntropy Semelhante ao método MaxEntropy, mas usando a entropia Renyis. Kapur, JN Sahoo, PK amp Wong, ACK (1985), um novo método para o limiar de imagem de nível de cinza usando a entropia do histograma, modelos gráficos e processamento de imagem 29 (3). 273-285 Ported from ME Celebis fourier0.8 rotinas 9 e 10. Ported from ME Celebis fourier0.8 rotinas 11 e 12. Esta é uma implementação do método Triangle: Modificado a partir de Johannes Schindelins plugin TriangleAlgorithm. O algoritmo Triângulo, um método geométrico, não pode dizer se os dados estão distorcidos de um lado a outro, mas assume um pico máximo (modo) perto de uma extremidade do histograma e busca para a outra extremidade. Isso causa um problema na ausência de informações sobre o tipo de imagem a ser processada ou quando o máximo não está próximo de um dos extremos do histograma (resultando em duas possíveis regiões de limiar entre o máximo e os extremos). Aqui, o algoritmo foi ampliado para encontrar em qual lado do pico máximo os dados são os mais distantes e busca o limite dentro desse maior alcance. Implementa o método de limiar Yens de: Ported from ME Celebis fourier0.8 rotinas 13 e 14.Processamento de intensidade de imagem O brilho é a percepção visual da luz refletida. O brilho aumentado refere-se a uma luminância aumentada de imagens. O contraste é a separação das partes mais claras e mais sombrias de uma imagem. Um aumento no contraste escurecerá sombras e aliviará os destaques. O contraste crescente geralmente é usado para tornar os objetos em uma imagem mais distintos. Ajuste o brilho e o contraste com o Ajuste de Imagem BrilhoContrast. Para facilitar a visualização da imagem. Pressione o botão Auto para aplicar um estiramento de contraste inteligente à exibição da imagem. O brilho eo contraste são ajustados levando em consideração o histograma das imagens. Se pressionado repetidamente, o botão aumenta a porcentagem de pixels saturados. O botão Redefinir faz o máximo de 0 e o mínimo de 255 em imagens de 8 bits e o máximo e mínimo igual aos valores de pixel menores e maiores no histograma de imagens para imagens de 16 bits. Se o botão Auto não produzir um resultado desejável, use a ferramenta de região de interesse (ROI) para selecionar parte da célula e algum plano de fundo, e aperte novamente o botão Automático. O alongamento será baseado nas intensidades do ROI. Pressionar o botão Aplicar permanentemente altera os valores reais de cinza da imagem. Se apenas analisar a intensidade da imagem não pressionar este botão. Se você preferir que a imagem seja exibida como preta em branco e não em branco em preto, use o comando invertido: Mesas de pesquisa de imagens Inverter LUT. O comando Editar Inverter inverte os próprios valores de pixel permanentemente. Obtendo valores de intensidade a partir de ROI único Se estiver trabalhando com uma pilha, o ROI selecionado pode ser analisado com o comando: Image Stacks Plot Z Axis Profile. Isso gera uma única coluna de números - uma intensidade de fatia por linha. As 6 principais linhas da coluna são detalhes do ROI. Isso garante que o mesmo ROI não seja analisado duas vezes e permite economizar ROIs interessantes. Os detalhes são compostos de área, coordenadas x, coordenadas y, AR, redondeza e solidez do ROI. Se o ROI é um ROI de polylinegtreeger ao invés de um squaregtoval, ele age como se o ROI fosse um ovalgtsquare. O ROI (oval) pode ser restaurado digitando os detalhes solicitados pelo comando Editar Seleção de Restauração (hotkey: CtrlShift E). Os resultados são exibidos em uma janela de argumento com os detalhes do ROI no título da janela do enredo. O gráfico contém os botões Lista, Salvar, Copiar. O botão Copiar coloca os dados na área de transferência para que possa ser colado em uma folha do Excel. As configurações do botão de cópia podem ser encontradas em Opções de traço de perfil de opções de edição. As configurações recomendadas incluem: Não salve os valores de x (evita que os dados do número da fatia sejam colados no Excel) e o Autoclose para que você não tenha que fechar o gráfico analisado de cada vez. Análise de intensidade dinâmica versus tempo O perfil do eixo Z do traçado (este é o Z Profiler de Kevin (Gali) Baler (gliblr at yahoo) e Wayne Rasband simplesmente renomeado) monitorará a intensidade de um ROI móvel usando uma ferramenta de rastreamento de partículas. Esta ferramenta pode ser manual ou automática. Use o comando Profile Stacks Plot Z Axis Profile. Obtendo valores de intensidade de ROIs múltiplos Você pode analisar múltiplos ROI de uma só vez com o plugin Multi Measure de Bob Doughertys. A função de gerenciador ROI nativo faz um trabalho semelhante, exceto não gera os resultados em colunas ordenadas. Consulte o site Bobs para obter atualizações. O plugin Multi Measure que vem com a instalação é v3.2. Abra a série confocal e remova o plano de fundo (veja a correção de fundo). Gerar uma pilha de referência para a adição de ROIs. Use a função do projeto Z-project da imagem e selecione a Média. Renomeie esta imagem algo memorável. Abra o plugin ROI Manager (Ferramentas de análise do Roi Manager ou ícone da barra de ferramentas). Selecione ROIs e Adicione ao gerenciador de ROI. Clique no botão Mostrar tudo para ajudar a evitar a análise da mesma célula duas vezes. Depois de selecionar ROIs para serem analisados ​​na imagem de referência, você pode desenhá-los para a imagem de referência clicando no botão Moregtgt e selecionando Draw. Salve a imagem de referência na pasta de dados de experiências e clique na pilha a ser analisada. Clique no botão Moregtgt no gerenciador ROI e selecione o botão Multi Measure para medir todos os ROIs. Clique em OK. Isso colocará os valores de cada fatia em uma única linha com várias colunas por fatia. Ao clicar em Medir, as 50 fatias colocam todos os valores de todas as fatias e cada ROI em uma única coluna. Vá para a janela Resultados e selecione o item de menu Editar Selecionar tudo. . Então EditCopy. Vá para o Excel e cole os dados. Verifique se tudo foi colado corretamente 10. Para copiar as coordenadas de ROI na planilha do Excel, é necessário que haja uma linha vazia acima dos dados de intensidade. Use a caixa de diálogo Multi Measure e clique no botão Copy list. 14. No Excel, clique na célula vazia acima da primeira coluna de dados e cole as coordenadas ROI. Salve os ROIs com o botão Multi Measure Save. Coloque-os na pasta de dados experimental. Os ROIs podem ser abertos mais tarde, individualmente, com o botão Abrir ou tudo ao mesmo tempo com o botão Abrir Tudo. Os ROI oval e retangulares podem ser restaurados individualmente de valores x, y, l, h com o ROI dos plugins. Especificar ROI. comando. A imagem analatológica compara as gravações de dois sinais diferentes para ver se existem semelhanças entre eles. É feito dividindo um canal por outro canal para produzir um terceiro canal ratiométrico. Esta técnica é útil porque corrige o vazamento do corante, o carregamento de corante desigual e a foto-branqueamento. Um exemplo de aplicação seria medir o íon intracelular, o pH e a dinâmica da voltagem em tempo real. A subtração de fundo é necessária antes da análise de imagens de proporção de canal duplo. Veja também a seção de correção de fundo. O complemento RatioProfiler realizará análise ratiométrica de um ROI único em uma pilha entrelaçada de dois canais. As fatias ímpares são imagens do canal 1 e as fatias pares são imagens do canal 2. Se seus dois canais são abertos como pilhas separadas, como Zeiss, os dois canais podem ser intercalados (misturados entre eles alternando entre eles) com o comando de menu Plugins Stacks - Shuffling Stack Interleaver. O plugin gerará um gráfico verde dos valores da relação. Ch1Ch2 é o padrão e você pode obter Ch2Ch1 se o plugin for executado com a tecla Alt para baixo. Também gerará um segundo gráfico das intensidades dos canais individuais, Ch1 e Ch2, bem como uma tabela de resultados. A primeira linha da tabela de resultados contém valores para x, y, largura e altura do ROI. A partir da segunda linha para baixo, a primeira coluna é o tempo (número da fatia), a segunda coluna é a intensidade média Ch1 e o terceiro canal é a intensidade média Ch2 e o valor da relação. A pilha deve ter seu intervalo de quadros calibrado para que o valor de Tempo seja em segundos. Caso contrário, é Slices. O intervalo de quadros pode ser configurado para a pilha através do comando de menu Propriedades da imagem. Esta tabela pode ser copiada para a área de transferência e colada em outro lugar com o comando Edit Copy All. Análise da relação Usando o gerenciador ROI 1.Subraque o plano de fundo da imagem. 2. Abra o gerenciador de ROI (gerenciador de ROI das análises de ferramentas) e clique no botão Mostrar tudo. 3. Selecione as células a serem analisadas e adicione-as ao gerenciador de ROI (botão Adicionar ou tecla T do teclado). 4. Execute o plugin. A janela de resultados contém a média de ch1 e ch2 e sua relação. Cada linha é um ponto de tempo (fatia). A primeira linha contém os detalhes do ROI. Para gerar uma imagem de referência: Aplique a pilha com o comando do menu (Pilhas de imagem Projeto Z com Tipo de projeção: Máximo), Ajuste o brilho e contraste, se necessário. Selecione a nova imagem e clique no botão Mais no gerenciador de ROI. Depois disso selecione o rótulo. Obtendo dados do timestamp O LSM Toolbox é um projeto que visa a integração de funções úteis comuns em torno do formato de arquivo Zeiss LSM, que deve aumentar a usabilidade de arquivos LSM confocal mantidos em seu formato nativo, preservando assim todos os metadados disponíveis. Em Fiji, os comandos correspondentes são: Importar Arquivo Mostrar LSMToolbox que exibe a caixa de ferramentas, a partir da qual todos os comandos podem ser chamados e Ajuda Sobre os Plugins LSMToolbox. Que exibe informações sobre o plugin. Esta leitura pode ser encontrada usando o comando do menu Image Show Info. . Desloque-se para obter o tempo que cada fatia foi adquirida. Selecione essa hora, copie-o no Excel e encontre o número de tempo obtido usando o comando de menu do Excel, Editar Substituir. Isso deixará apenas os dados do tempo. O tempo decorrido pode então ser calculado subtraindo a linha 1 de todas as linhas subseqüentes. A Linescanning envolve a aquisição de uma única linha, de um pixel de largura, de um microscópio confocal comum em vez de uma imagem 2D padrão. Esta é geralmente uma maneira mais rápida de tirar uma imagem. Todas as imagens de um único pixel são empilhadas para recriar a imagem 2D. Uma geração pseudo-linear de uma imagem 3-D (x, y, t). É útil para exibir dados 3-D em 2 dimensões. Uma linha de interesse é desenhada, seguido do comando: Image Stacks Reslice ou com o botão do teclado. Ele irá pedir-lhe a largura da linha que você deseja ter em média. Ele gerará uma pilha de pseudo-linhas com cada fatia que representa o pseudo-linean de uma linha larga de um único pixel ao longo da linha de interesse. Média a pilha pseudo-linea selecionando Image Stacks Z-Project. E use o comando Average. Pode ser utilizada uma linha poligonal, mas isso só gerará uma única fatia de pixel. As configurações padrão do Fijis supõem que as pilhas são z - series em vez de t - series. Isso significa que muitas funções relacionadas à terceira dimensão de uma pilha de imagens são referidas com um z-. Basta manter isso em mente. Análise do FRAP (Recuperação de fluorescência após Photobleaching) O plugin de perfilador FRAP analisará a intensidade de um ROI branqueado ao longo do tempo e o normalizará contra a intensidade de toda a célula. Depois disso, encontrará a intensidade mínima no ROI branqueado e se encaixa na recuperação com este ponto em mente. Abra o gerenciador de ROI. Desenhe em torno do ROI branqueado e adicione-o ao gerente ROI. Desenhe em torno de toda a célula e adicione isso ao gerente ROI. A normalização corrige o branqueamento que ocorre durante a aquisição da imagem e assume que toda a célula está no campo de visão. O plugin pressupõe que o maior ROI dos ROIs é o ROI da célula inteira e que o ROI menor é a parte branqueada. Execute o plugin FRAP profiler. O plugin retornará a trama de intensidade vs tempo, a trama de intensidade normalizada vs. tempo da área branqueada e a curva ajustada. Expansão de contraste não linear Equalização Você pode ter mais controle sobre os ajustes de brilho e contraste com o comando do menu de contraste Process Enhance. Com uma pilha, analisa o histograma de cada fatias para fazer o ajuste. O comando Equalize contrast aplica um trecho não linear do histograma baseado na raiz quadrada de sua intensidade. Gamma executa um ajuste de histograma não-linear. Os objetos fracos tornam-se mais intensos enquanto objetos brilhantes não (gamma lt1). Além disso, os objetos de média intensidade tornam-se mais fracos enquanto objetos brilhantes não (gamma gt 1). A intensidade de cada pixel é aumentada para a potência do valor da gama e, em seguida, dimensionada para 8 bits ou as imagens mínimas e máximas de 16 bits. Para imagens de 8 bits, a nova gama de intensidade 255 (intensidade antiga255) pode ser ajustada através do comando Process Math Gamma. Isso permitirá que você ajuste a gama com a barra de rolagem. Clique em OK quando terminar. Você pode usar a barra de rolagem para determinar o valor da gama desejada em uma fatia de sua pilha. Há também uma opção para visualizar os resultados. Veja a referência online para obter uma explicação sobre filtros digitais e como eles funcionam. Os filtros podem ser encontrados usando o comando do menu Process Filters. . O filtro médio. O pixel é substituído pela média de si e seus vizinhos dentro do raio especificado. O item de menu Process Smooth é um filtro médio de 33. Filtro gaussiano. Isso é semelhante a um filtro de suavização, mas substitui o valor do pixel por um valor proporcional a uma distribuição normal de seus vizinhos. Filtro médio. O valor do pixel é substituído pela mediana de si e seus vizinhos adjacentes. Isso remove o ruído e preserva os limites melhor do que a simples filtragem média. O item do menu Process Noise Despeckle é um filtro mediano 33. Convolve filter: This allows two arrays of numbers to be multiplied together. The arrays can be different sizes but must be of the same dimension. In image analysis this process is generally used to produce an output image where the pixel values are linear combinations of certain input values. Minimum: This filter, also known as an erosion filter, is a morphological filter that considers the neighborhood around each pixel and, from this list of neighbors, determines the minimum value. Each pixel in the image is then replaced with the resulting value generated by each neighborhood. Maximum: This filter, also known as a dilation filter, is a morphological filter that considers the neighborhood around each pixel and, from this list of neighbors, determines the maximum value. Each pixel in the image is then replaced with the resulting value generated by each neighborhood. Kalman filter . This filter, also known as the Linear Quadratic Estimation, recursively operates on noisy inputs to compute a statistically optimal estimate of the underlying system state. Background correction can be done in multiple ways. A simple method is to use the Image Lookup Tables HiLo LUT to display zero values as blue and white values (pixel value 255) as red. With a background that is relatively even across the image, remove it with the BrightnessContrast command by slowly raising the Minimum value until most of the background is displayed blue. Press the Apply button to make a permanent change. Rolling-Ball background correction To fix an uneven background use the menu command Process Subtract background . This will use a rolling ball algorithm on the uneven background. The radius should be set to at least the size of the largest object that is not part of the background. It can also be used to remove background from gels where the background is white. Running the command several times may produce better results. The user can choose whether or not to have a light background, create a background with no subtraction, have a sliding paraboloid, disable smoothing, or preview the results. The default value for the rolling ball radius is 50 pixels. Process Subtract Background.